肝素是一種高度磺酸化的多糖，在多種生理和病理生理功能中發(fā)揮著重要作用。肝素2?O?磺基轉(zhuǎn)移酶(2-OST)是肝素生物合成過(guò)程中第二步磺酸化修飾的關(guān)鍵酶，利用磺酸基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）將磺酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至己糖醛酸殘基的C2位點(diǎn)，從而生成2-O-磺酸化的IdoA2S或GlcA2S。然而，表達(dá)量與酶活性低等問(wèn)題限制了其應(yīng)用。為此，團(tuán)隊(duì)采用多種策略來(lái)提高表達(dá)水平、催化性能及穩(wěn)定性。首先，基于多策略協(xié)同的2-OST的N端工程化改造以實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)。通過(guò)篩選促溶標(biāo)簽，確定SUMO標(biāo)簽為最優(yōu)選擇，并結(jié)合剛性連接肽PAPAP，使2-OST酶活性提升至387.40 U/mL。隨后，進(jìn)一步采用N端同義密碼子優(yōu)化策略，利用FACS技術(shù)篩選出高表達(dá)突變體菌株。經(jīng)驗(yàn)證，NCS-14菌株的表達(dá)水平顯著提高，較野生型提高1.48倍，其酶活達(dá)到了606.79 U/mL，是原始活性的1.78倍。

隨后，采用半理性設(shè)計(jì)策略，對(duì)SUMO-Ga2OST的穩(wěn)定性與催化性能進(jìn)行改造。借助HotSpot Wizard、FireProt等計(jì)算工具并結(jié)合深度進(jìn)化分析鎖定了21個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。對(duì)比評(píng)估野生型與突變體的表達(dá)及催化性能發(fā)現(xiàn)，雙點(diǎn)突變體SUMO-Ga2OST A98K/Y145F比酶活提升2.32倍，催化效率（kcat/Km）提高1.89倍，穩(wěn)定性增強(qiáng)7.8倍。SAX-HPLC分析表明，其對(duì)CDSNS肝素底物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)72.43%，轉(zhuǎn)化效率提升1.48倍。三維結(jié)構(gòu)與分子動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)，兩處突變顯著增強(qiáng)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。最后，對(duì)突變體進(jìn)行5 L罐分批補(bǔ)料發(fā)酵，誘導(dǎo)21 h后OD600為52.00，酶活達(dá)峰值5720 U/mL，蛋白產(chǎn)量達(dá)37.23 mg/g DCW。

以上研究為未來(lái)在肝素生產(chǎn)和其他磺基轉(zhuǎn)移酶改造工藝中的生物工程應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。相關(guān)策略也可以擴(kuò)展到優(yōu)化糖胺聚糖相關(guān)酶，推進(jìn)臨床多糖生產(chǎn)。

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