肝素是一種高度磺酸化的多糖，在多種生理和病理生理功能中發揮著重要作用。肝素2?O?磺基轉移酶(2-OST)是肝素生物合成過程中第二步磺酸化修飾的關鍵酶，利用磺酸基供體3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（PAPS）將磺酸基團轉移至己糖醛酸殘基的C2位點，從而生成2-O-磺酸化的IdoA2S或GlcA2S。然而，表達量與酶活性低等問題限制了其應用。為此，團隊采用多種策略來提高表達水平、催化性能及穩定性。首先，基于多策略協同的2-OST的N端工程化改造以實現其高效表達。通過篩選促溶標簽，確定SUMO標簽為最優選擇，并結合剛性連接肽PAPAP，使2-OST酶活性提升至387.40 U/mL。隨后，進一步采用N端同義密碼子優化策略，利用FACS技術篩選出高表達突變體菌株。經驗證，NCS-14菌株的表達水平顯著提高，較野生型提高1.48倍，其酶活達到了606.79 U/mL，是原始活性的1.78倍。
隨后，采用半理性設計策略，對SUMO-Ga2OST的穩定性與催化性能進行改造。借助HotSpot Wizard、FireProt等計算工具并結合深度進化分析鎖定了21個關鍵氨基酸位點。對比評估野生型與突變體的表達及催化性能發現，雙點突變體SUMO-Ga2OST A98K/Y145F比酶活提升2.32倍，催化效率（kcat/Km）提高1.89倍，穩定性增強7.8倍。SAX-HPLC分析表明，其對CDSNS肝素底物的轉化率高達72.43%，轉化效率提升1.48倍。三維結構與分子動力學分析證實，兩處突變顯著增強了蛋白質穩定性。最后，對突變體進行5 L罐分批補料發酵，誘導21 h后OD600為52.00，酶活達峰值5720 U/mL，蛋白產量達37.23 mg/g DCW。
以上研究為未來在肝素生產和其他磺基轉移酶改造工藝中的生物工程應用提供了堅實的基礎。相關策略也可以擴展到優化糖胺聚糖相關酶，推進臨床多糖生產。
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